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質粒提取試劑盒中各溶液配方及作用

2022-12-22 10:40 來源:上海遠慕生物試劑
提質粒是分子生物學中基本,easy的實驗。完全不需要借助大腦,直接照著提取試劑盒中的操作說明傻瓜操作即可(其實應該由機器人在實驗室中操作這些簡單卻耗時的實驗)。盡管操作簡單,提質粒卻也是一個比較重要的步驟,提出質粒的質量和數量將直接決定著后續實驗室的成敗。當我們按照試劑盒中操作說明進行操作時,我們會看到P1,P2,N3, PE,EB等不同的溶液(不同試劑盒可能標識不同)。那么大家是否知道每瓶溶液中裝的什么?它們在質粒提取過程中的作用又是怎樣的?
質粒提取采用的是強堿裂解法(alkaline lysis),那么我們現在來看一下溶液 P1 , P2, N3, PE, EB都是什么。

溶液1(P1)

組分濃度 25 mM Tris-HCl(pH8.0),10 mM EDTA,50 mM 葡糖糖(Glucose)

溶液1的主要作用是將菌體沉淀懸浮起來。25mM Tris-HCl是緩沖溶液,保證反應體系的pH恒定。EDTA是金屬離子螯合劑,10 mM EDTA的作用是與微生物體內的金屬離子相互結合,抑制DNase的活性。50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,保證菌體懸浮,延緩菌體沉降的時間。溶液1在使用前通常要加入RNA酶(RNase A),RNA酶的作用很清楚,降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶屬于蛋白質,蛋白質穩定性很差,所以加了RNase A的溶液1需要低溫4oC保存。

溶液2(P2)

組份濃度 250 mM NaOH,1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)

溶液2的主要作用是細胞裂解。溶液1將細胞懸浮后,就需要添加溶液2了,溶液2的作用就是對細胞進行裂解。溶液2只包括兩種成分:氫氧/化鈉和SDS。真正起到到細胞裂解作用的是氫氧/化鈉,這也是為什么這個方法會被叫做堿裂解法。氫氧/化鈉會破壞細胞膜的結構,使之發生bilayer(雙層膜)結構向micelle(微囊)結構的相變化,從而導致細胞的裂解。SDS的作用將在下一步提到。添加溶液2后需要注意的一個是時間一定不能過長,另一個是不可以劇烈震動離心管。時間過長以及劇烈震動都將導致氫氧/化鈉破壞基因組DNA,斷裂的基因組DNA碎片將會與相似大小質粒一同被抽提,污染樣品。

溶液3(N3)

組份濃度 3M 醋酸鉀(potassium acetate),5M 醋酸

溶液3的主要作用是中和第二步加入的強堿以及清除掉蛋白質等細胞內的雜質。N是neutralized的縮寫。強堿溶液氫氧/化鈉長時間與DNA基礎會破壞其結構,因此需要進行中和。中和氫氧/化鈉,5 M醋酸就足夠了,為何又要加入醋酸鉀呢?做過質粒提取實驗的同學應該記得,在加入溶液N3后,會有大量沉淀出現。這些沉淀其實醋酸鉀與溶液2中的SDS相互作用,反應生成的十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate, PDS)。加入溶液N3后,SDS遇到鉀離子,生成PDS不溶于水,會迅速發生沉淀。

那么溶液3的加入是如何清除掉蛋白質,基因組DNA等雜質的呢?道理是,溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)很容易與蛋白質結合,平均兩個氨基酸就會結合一個SDS分子,二者結合會形成SDS2多肽復合體,這樣變性蛋白質將溶解在溶液中,從而使得多肽鏈更好地與基因組DNA纏繞。加入溶液3后,由于十二烷基硫酸鹽與變性蛋白質結合成復合體,十二烷基硫酸鉀的沉淀就將變性的蛋白質一起沉淀,同時變性的蛋白質與基因組DNA纏繞,結果也大部分被共沉淀了。而高離子濃度的溶液又加速了這一沉淀過程。此外,溶液被中和后變性蛋白質表面電荷減少,也可以促進變性蛋白質沉淀。

溶液PE (wash buffer)

組分濃度10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 % 乙醇(Ethanol)

Wash buffer的作用主要是清洗掉多余的鹽離子。試劑盒中都是利用硅膠柱進行DNA提取的。在DNA與硅膠柱吸附后,需要利用Wash buffer清洗掉多余的鹽離子。Wash buffer中含有高濃度的乙醇,由于乙醇會影響后續的酶切或測序反應,在洗脫DNA前必須要在離心機內”空甩”柱子,完全清除掉乙醇。

溶液EB(Elution buffer)

組分濃度10 mM Tris-HCl (pH 7.5)

EB的作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。Elution buffer中不能含有過高濃度的鹽離子,因為在高鹽環境中,鹽陽離子會打破硅膠負氧根和水之間的氫鍵,使得整體的硅膠攜帶正電,會吸引攜帶負電的DNA分子。另外,加熱過的洗脫液(<50°C)可以加速DNA從硅膠膜上脫離下來。另外,離心前保持EB緩沖液在膜上停留時間長一些,將更有利于DNA的洗脫。

不同公司的質粒提取試劑盒中溶液成分可能有所差異,比如P1中可以去除掉葡萄糖,溶液PE甚至可以直接用水來代替等等。質粒提取實驗是分子生物學中的基本且重要的實驗,盡管實驗本身簡單,但其原理還是有些復雜的。小編相信,知其然亦要知其所以然,清楚實驗的原理,當實驗出現問題之時,會能夠更容易找到原因并給予糾正。
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