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遠慕分享PCR緩沖液的相關介紹

2022-12-27 11:37 來源:上海遠慕生物試劑
用于PCR的標準緩沖液見PCR操作范例。于72℃時,反應體系的pH值將下降1個單位,接近于7.2。二價陽離子的存在至關重要,影響PCR的特異性和產量。實驗表明,Mg2 優于Mn2 ,而Ca2 無任何作用。
1.Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP濃度為200mmol/L時),但并非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時,都要把Mg2 濃度調到最佳,其濃度變化范圍為1~10mmol/L。Mg2 過量易生成非特異性擴增產物,Mg2 不足易使產量降低。

樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根,會與Mg2 結合而降低Mg2 有效濃度。因此,用作模板的DNA應溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

dNTP含有磷酸根,其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此,在高濃度DNA及dNTP條件時,必須相應調整Mg2 的濃度。

2.Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris –HCl緩沖液,很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液,pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此,20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時,在典型的熱循環條件下,真正的pH值在7.8~6.8之間。

3.KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但研究表明,NaCl濃度在50mmol/L時,KCl濃度高于50mmol/L將會抑制Taq酶的活性,少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。

4.明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為100μg/ml,但現在的研究表明,加或不加都能得到良好和PCR結果,影響不大。

5.二甲基亞砜(DMSO)在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的;加入10%DM-SO有利于減少DNA的二級結構,使(G C)%含量高的模板易于完全變性,在反應體系中加入DMSO使PCR產物直接測序更易進行,但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性,因此,大多數并不使用DMSO。

PCR中Ph緩沖液的作用

第一,PCR緩沖液就是給PCR反應提供的一個最適酶催反應條件。

第二,例如緩沖液中的鎂離子在酶催化過程中,結合到酶-底物結合體上,從而使催化反應的活化能更加降低。使得反應能夠進行。

第三,PH緩沖液是保證PCR反應正常進行的關鍵條件之一。
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