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蛋白標準品(Marker)知識匯總!

2022-12-29 15:46 來源:上海遠慕生物試劑
蛋白Marker可分為:一、未預染的Marker即寬分子 量蛋白標準、高分子量蛋白標準以及低分子量蛋白標準;二、預染的Marker即單色預染和多色預染。在western blot 過程中,分子量Marker就像個螺絲釘一樣沒雖然是個小細節,然而就是這樣一個小細節對實驗結果有著不可忽視的作用。

這個 Western Blot參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小,只有標準量精確無誤了,實驗結果才有說服力,除此之外,蛋白標準還有表示轉移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用,所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實驗成功的必要條件之一。
總體來說,蛋白分子量標準可以分成未染蛋白分子量標準、預染蛋白分子量標準二個級別。以下是關于蛋白分子量標準的小敘:

一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量標準

未染色的蛋白分子量標準是最簡單,也是最準確的一種。由于沒有附帶染料分子或者是標記分子,所示大小正好是蛋白原本的大小,是精確判斷蛋白大小必須的?,F在的Marker多數都選用預混和的Marker,方便不同大小的蛋白比較。

預混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示,因為混合的條帶越多,越不好記,誰知道哪條是那條!數到眼都花了。所以當看到特別濃的那幾條標志帶就記得是哪里了。

不過要記得,小帶通常都不那么容易看清楚的。在選擇上來說,當然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的最好,越近越好。如果你的蛋白不幸在兩條跨度較大Marker條帶之間,選別的Marker吧。

預混的Marker使用上不如預染Marker(pre-stained)好用,因為電泳過程中完全看不到,要和目標蛋白一起等到最后染色才“開蠱”,無法對實驗起預示參照作用。完全屬于“后知后覺”型的,當然還是比“不知不覺”不做對照的要好。

① 寬分子量蛋白標準

如果從實驗室總體考慮的,就選范圍盡量寬,條帶分布比較均勻的,這樣你的蛋白無論在哪個區間都容易判斷,避免正好落在一段空白區的危險。不過條帶越多,每次上樣量也就越費。拿到Marker后,如果買的是大包裝,就應該考慮分裝。

多次反復凍融對于蛋白的危險,不用多說吧。另外要記得,寬譜的Marker不一定每條都能看到的,特別是Mini Cell 。如果側重大蛋白,那小的可能就已經跑掉了,不是質量不好哦。

② 高分子量蛋白標準

通常在檢測大分子量蛋白經常使用到高分子量蛋白標準,

③ 低分子量蛋白標準

在一般的蛋白電泳當中,更常用的是低蛋白標準分子量,除了有指示蛋白大小的作用以外,有時還可以用作粗略的定量。實驗室用在一般蛋白電泳的低分子量蛋白標準中。

在低分子量蛋白標準這里還包括可特別小的蛋白標準,比如30kD以下蛋白或者多肽的分離辨別。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白標準挺不錯,另外提醒一句,特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色好,上樣一定要上足夠的量哦。

二.預染蛋白分子量標準

預染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物,通過與染料共價耦聯,在電泳過程中或者轉膜時可以直接觀察到。

預染蛋白分子量的出現方便了我們的實驗,這種蛋白分子量標準可以幫助我們在電泳時、電泳后,以及轉膜后監測電泳情況和估計遷移率——比如,已知垂直電泳最佳分辨區域大約在膠的2/3處。

如果使用預染Marker就可以預測目標蛋白進入最佳分辨區時停止電泳以得到最佳分辨效果;如果觀察到Marker電泳異常也可以及時終止電泳;另外在Western Blot轉膜以后可以直接觀察蛋白轉膜是否完全,還可以在膜上標記蛋白分子量,所以吸引了許多實驗室人員購買預染蛋白標準。

值得注意的是預染蛋白Marker與染料共價耦聯,所以在不同的緩沖條件下電泳時遷移特性可能會發生某些變化,可能導致一些偏差,所以不太適合精確定位蛋白——不過多數情況下Marker的條帶未必能和我們的目標蛋白完全一樣,我們得到的也不過是一種相對Marker指示的參考大小,最后都需要Western來定性,所以如果不是要區分大小相近的條帶,預染Marker還是很好用的,而且也可以和未染色的蛋白標準一起使用。

預染蛋白標準可以分為兩種:單色預染和多色預染,其實區別就在于幫助在實驗過程中辨認某個條帶的大小——Marker條帶越多參考價值越大,可就越難辨認區分,如果用不同的顏色來區別就比較好辨認啦。如果沉悶的電泳實驗中跑出五顏六色的彩虹Marker,此時心情想必會愉快一些!

單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的。還有一點特別要注意,由于轉膜是一個將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上,所以需要的上樣量相對少一些,如果想要在電泳過程中看到美麗的“彩虹”,或者單色的Marker往往需要比說明書里多加一些Marker的。

三、Western專用的蛋白分子量標準

①生物素標記蛋白標準

未染色的Marker在做Western時,需要在印跡前先用麗春紅或者是SYPRO熒光蛋白染色液等不干擾Western Blot的染色方法顯色,在膠上做標記最后才能“拼”在最后的結果中,如果是預染的Marker就要在轉膜后標記膜,或者剪膜,最后在“拼上”。

要是想直接將Marker結果顯示在最后結果上,不用手工作圖或者拼接,那就要Western專用的Marker了。比如生物素標記的蛋白標準。這種方法主要是配合化學發光法:在蛋白分子量上標記生物素,通過帶有抗生物素的抗體或者偶聯鏈親霉素的抗體,在化學發光檢測到目的蛋白帶時就可以同時看到相應的分子量標準一起發光顯影了。

不同于普通蛋白分子量標準的便宜、預染蛋白分子量的方便,這一方法的優點是與Marker和目的蛋白對應性好,同時在同張片上顯示,不用拼接,利于分析。缺點是如果樣品中帶有生物素背景,那個抗生物素抗體有可能影響結果,而且反應體系太過復雜也會干擾實驗結果。

②特殊標記蛋白標準

在經過修飾的蛋白標準中,除了生物素標記以外,近些年由于下游蛋白操作的豐富化與復雜化,也出現帶有“尾巴”的蛋白標準。比如His-Tag,如果每個Marker條帶都有His –tag,那二抗添加His-Taq抗體很容易將Marker條帶顯示在Western結果上。

很方便,問題就是有可能有潛在的干擾,比如樣品中正好有類似Histag的結構。不過這可以通過對照檢測的。
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